روش تعیین توالی سانگر یا روش ختم زنجیره
با این روش قطعات ۴۰۰ تا ۹۰۰ جفت بازی قابل شناسایی است.
در این روش نیازبه :
قطعه DNA، پرایمر(یک پرایمر)، dNTP ها، ddNTP ها می باشد که نسبت آن به dNTPیک به ده می باشد و آن ها را با ماده رنگی فلورسانس نشاندار شده اند.
در این روش چهار لوله آزمایش تهیه و در هر لوله از قطعه مورد نظر پرایمر،dNTP، اضافه و در هر لوله یکی ازddNTP ها ریخته و پس از پایان واکنش هر لوله به طور مجزا الکتروفورز (یا در لوله مویینه ویا در چاهک ژل) و نتایج بررسی می شود.
باز ddNTPمثل باز نرمال بوده و فقط در محل کربن ۳بجای OH، فقط H دارد واگر در انتهای قطعه قرار بگیرد منجر به ختم زنجیره می گردد.
نکات مهم
- در این روش DNAپلی مراز قادر به تفکیک باز نرمال و باز ختم دهنده نیست.
- این روش تا حدی شبیه همانند سازی و تا حدی شبیه به واکنش زنجیره ای پلی مراز است.
- DNA پلی مراز کاربردی خاصیت اگزونوکلئازی ۵-۳و۳-۵ را ندارد.(از آنزیم سکوناز استفاده که نوعی پلی مراز تغییر یافته است استفاده می شود؛ این آنزیم توسط فاژ T7کد می شود و پیمایش زیادی دارد.
- در این روش چون فقط یک رشته تکثیر می یابد رابطه خطی برای تکثیر برقرار است ولی در PCR رابطه تکثیر نمایی است.
- از پرایمرهای عمومی برای اتصال به نقاط قبل از شروع قطعه استفاده می شود(یعنی توالی یابی با بخش کوچکی از DNAحامل شروع و به سمت قطعه کلون شده ادامه می یابد).
- می توان از پرایمرهای اختصاصی هم استفاده کردکه به محل های خاص از الگو متصل وتوالی را به سمت خاص گسترش داد.
- در روش سانگر توالی به دست آمده مکمل توالی اولیه است زیرا این محصول است که بررسی می شود و برای به دست آوردن توالی اصلی مکمل آن را می نویسیم. می توان برای رد یابی بازها هم از مواد رادیو اکتیو و هم از مواد فلوئورسانس استفاده نمود.
پس از پایان ساخت زنجیره قطعات را با حرارت ویا اوره جدا و الکتروفورز کرده و بررسی می گردد.
روش ماکسام وگیلبرت
چها رلوله آزمایش تهیه و ازDNA تک رشته ای به این لوله ها اضافه شده و بر روی این لوله ها با توجه به شکل زیر از مواد شیمیایی تخریب گر اسید های نوکلئیک (برای پورین ها ازپیپریدین به کار برده می شود، که در مجاورت دی متیل سولفات برای تخریب گوانین ودر مجاورت بااسید فورمیک برای تخریب گوانین و آدنین استفاده می شود).
برای تخریب پیریمیدین ها نیزاز هیدرازین استفاده می شودکه موجب تخریب سیتوزین وتیمین می شود و با اضافه کردن سدیم کلراید به آن اختصاصی برای هیدرولیز سیتوزین می گردد.
نکات مهم در روش ماکسام گیلبرت:
- هر لوله به طور مجزا در ژل پلی آکریل آمید الکتروفورز می شود.
- پس از الکترو فورز هر ستون یک باز را نمایان می کند.
- نمونه با شاهد که از نظر تعداد نوکلئوتید مشخص است الکتروفورز می شوند.
- یک فیلم حساس به اشعهX در روی ژل قرار داده و نواحی دارای فسفر رادیو اکتیوبه صورت نوارهای تیره دیده می شوند که به این روش اتو رادیو گرافی گویند.
- باید شکست قطعات طوری باشد که قطعات نشاندار با فسفر رادیو اکتیو حاصل شود.
- هیدرولیز قطعات بایدبه طور ناقص صورت گیرد(شرایط و مدت زمان واکنش های هیدرولیز کننده باید طوری تنظیم شود که هر رشته فقط در یک مکان شکسته شود؛ اگر شکستن بطور کامل و در تمامی بازها یکسان ایجاد شود در انتها فقط قطعات یکسان داریم).
- شکست باز در محل قبل از خود باز صورت می گیرد و باز مد نظر حذف می شود.
- فسفررادیو اکتیو آزاد بصورت یون فسفات آزاد می شود و در مراحل بعدی قابل دید نیست.
- باز انتهای ۵ رشته با این روش قابل شناسایی نیست و به جای آن از علامت (–) استفاده می شود.
- باز اول قطعه را از رشته مقابل تعیین می کنند.
یک دیدگاه