چرخه زندگي يک رتروويروس
دسامبر 11, 2019خطوط سلولي بسته‌بندي کننـــده
دسامبر 14, 2019 حامل‌های ويروسی
حامل‌های ويروسی
حامل‌هاي بيولوژيکي عمده که در حال حاضر در پروتکل‌هاي ژن درماني به کار مي‌روند از ويروس‌هاي پستانداران به دست مي‌آيند که مي‌توانند وارد سلول شده و ژن‌هايشان را در آنجا بيان کنند. حامل‌هاي ويروس، ويروس‌هايي هستند که از لحاظ ژنتيکي به گونه‌اي دگرگون شده‌اند که هنوز مي‌توانند به سلول وارد شوند و ژن‌ها را بيان کنند. اما ديگر نمي‌توانند تکثير شده و سلول‌های دیگر را عفوني يا آلوده کنند. در حال حاضر ويروس‌هاي حاوي DNA و RNA در ژندرماني براي ايجاد حامل به کار مي‌روند.
آن دسته از حامل‌هاي ويروسي که امروزه بيشترين مورد استفاده را در مطالعات انتقال ژن دارند و بسيار توسعه يافته‌اند، حامل‌هاي رتروويروسي نام دارند. رتروويروس‌ها ويروس‌هاي حاوي RNA هستند که بسياري از انواع سلول‌هاي در حال رشد را آلوده کرده و يک نسخه از ژنوم آنها را به طور تصادفي به کروموزوم‌هاي ميزبان مي‌فرستند و در اين صورت سلولي با ژنوم ويروسي منسجم و پايدار توليد مي‌کنند. اکثر حامل‌هاي رتروويروسي موجود از ويروس مولوني مورين لوکميا به دست مي‌آيند این ويروس که در سطح مولکولي به خوبي مطالعه شده است و به راحتي در محيط کشت قابل دستکاري مي‌باشد.
چرخه زندگي يک رتروويروس
در شکل چرخه زندگي يک رتروويروس نشان داده شده است. ژنوم رتروويروس‌ها از RNA تشکيل شده و دربردارنده اطلاعاتي براي ۳ ژن ويروسي با نام‌هاي gag، pol و env مي‌باشد. ژن gag پروتئين هسته يا پروتئین اصلي ويروس را رمزگذاري مي‌کند. ژن pol براي رونويسي معکوس که در تشکيل يک DNA واسطه از RNA ضروريست به کار مي‌رود و ژن env پروتئين‌هاي پوششي ويروس را رمزگذاري مي‌کند. اين ژن‌ها که پروتئين‌هاي عمل کننده در ترانس را رمز گذاري مي‌کنند براي تکثير و توليد ويروس لازمند. علاوه بر اين سه ژن که براي پروتئين‌هاي عمل کننده در ترانس رمز گذاري مي‌شوند، ژنوم ويروس دربردارنده چندين توالي نوکلئوتيدي عمل کننده در سيس است که پروتئينی را رمزگذاري نمي‌کنند. اين توالي‌ها شامل تکرار‌هاي بلند انتهايي ‘۳ و ‘۵ مي‌باشند(LTRs) که از پروموتور، سيگنال‌هاي پلي‌آدنيلاسيون و ادغام و يک توالي بسته‌بندي به نام ساي تشکيل شده‌اند.
ويروس با اتصال به يک گيرنده مشخص در سطح سلول که با پروتئين پوششي ويروسي بر هم کنش داشته، فيوژن ويروس و غشاي سلول را به وجود آورده، سلول‌هاي در حال رشد را آلوده مي‌کند. به دنبال اين فيوژن، ويروس به داخل اندوزوم اندوسيتوز مي‌شود. آزاد‌سازي از اندوزوم توسط يک عمل هدايت شده به وسيله پروتئين ويروسي انجام مي‌گردد. با رهاشدن از اندوزوم، ژنوم RNA به شکل معکوس به DNA رونويسي مي‌شود. مولکول دورشته‌اي DNA به هسته وارد شده و به طور تصادفي به درون کروموزوم‌هاي سلول نفوذ مي‌کند. ورود به هسته مستلزم فروپاشي غشاي هسته است که تنها در ميتوز اتفاق مي‌افتد و از اين رو، عفونت رتروويروسي به سلول‌هاي در حال تقسيم و داراي رشد فعال محدود مي‌شود.
وقتي DNA ويروس وارد DNA کروموزومي شد، به صورت پايدار باقي مانده و به مولکول RNA که کل توالي ژنوم ويروسي را در بر دارد، رونويسي مي‌شود. با استفاده از توالي ساي، مولکول RNA به شکل ذرات ويروسي جديد بسته بندي شده که اين ذرات طي فرايند جوانه زدن سلول از آن رها مي‌شوند. وجود DNA ويروسي در کروموزوم سلول بر متابوليسم يا رشد سلول که توسط آن سلول‌هاي پايدار دائماً ذرات ويروس را در جهت بقا و تکثير شدن توليد مي‌کنند، تاثيري ندارد.
خطوط سلولی بسته‌بندی کننـــده
هنگام آماده‌سازي حامل رتروويروسي معيوب، از يک خط سلولي بسته‌بندي کننده براي توليد پروتئين‌هاي gag، pol و env در ترانس استفاده مي‌شود. خطوط سلولي بسته‌بندي کننده توسط سلول‌هاي ترانسفکت شده با DNA ويروسي که توالي سيگنال بسته‌بندي ساي را حذف کرده اما حاوي اطلاعات ژنتيکي براي پروتئین‌های gag،pol و env مي‌باشد، توليد مي‌شوند. ژن‌هاي ويروسي به طور پايدار به کروموزوم‌هاي اين خطوط سلولي وارد شده و رونوشت‌هاي RNA را که پروتئين‌های gag،pol و env را رمزگذاري مي‌کنند، توليد مي‌نمايند. به هر حال، به علت نبود سيگنال بسته‌بندي ساي، مولکول‌هاي RNA نمي‌توانند درون ويريون‌هاي آلوده کننده بسته بندي شوند.
روند توليد حامل رتروويروسي با استفاده از اين خطوط سلولي بسته‌بندي کننده در شکل نشان داده شده است. در اين مثال، يک DNA تغيير‌يافته ويروسي ساخته مي‌شود که در آن توالي‌هاي ژنی gag،pol و env توسط ژن آدنوزين‌دآميناز(ada) و ژني به نام neo که يک ژن مارکر انتخابي مي‌باشد و سلول را در برابر آنتي بيوتيک مشابه نئومايسين به نام G418 مقاوم مي‌سازد، جايگزين مي‌شوند. اين مولکول DNA حامل، توالي‌هاي LTR و ساي را حفظ مي‌کند. DNA ويروسي اصلاح شده با استفاده از رسوب يا الکتروپوريشن فسفات کلسيم به درون خط سلولي بسته‌بندي کننده ترانسفکت مي‌شود و سلول‌ها در محيط حاوي G418 پخش مي‌شوند.
استفاده از آدنوويروس‌ها به عنوان حامل‌های ژن‌درمانی
آدنوويروس‌ها ويروس‌هاي حاوي DNA هستند که به طور معمول منجر به عفونت‌هاي تنفسي در انسان مي‌شوند. اندازه ژنوم آدنوويروسي ۳۸کیلوباز است و پس از حذف دو ژن اوليه آن با نام‌هاي E1 و E3 براي استفاده در ژندرماني اصلاح شده و اندازه آن به ۷ تا ۸ کیلوباز کاهش مي‌يابد. آدنوويروس‌ها محدوده ميزباني وسيعي دارند و هر دو نوع سلول تقسيم شونده و تقسيم نشونده را آلوده مي‌سازند. آنها توسط اندوسيتوز با واسطه گيرنده وارد سلول مي‌شوند و از مکانيسم کارآمدي در گسستن اندوزوم برخوردارند که اين ويژگي آنها را حامل‌هاي ويروسي ايده آلي براي ژندرماني قرار مي‌دهد. ويژگي منفي آنها اينست که وقتي DNA آدنوويروسي وارد هسته مي‌شود، وارد کروموزوم‌ها نشده و به صورت اپيزومي باقي مي‌ماند و پايداري و بيان طولاني‌مدت ژن‌هاي انتقال‌يافته را به يک مشکل جدي تبديل مي‌کند.
نتايج آزمايشات اوليه نشان مي‌دهد که به علت ايجاد التهاب و آنتي‌بادي‌هاي خنثي کننده بر عليه پروتئين‌هاي ويروسي به وجود آمده در بيماران، استفاده از حامل‌هاي آدنوويروسي فاقد ژن‌هاي E1 و E3 در ژندرماني نااميد کننده است. اين واکنش نامطلوب ميزبان تکرار به کارگيري ويروس را محدود کرده که به علت فقدان بيان پايدار و طولاني‌مدت ژن که در DNA آدنوويروسي اپيزومي مشاهده شده، ضروري به نظر مي‌رسد.
اخيرا، دو نمونه جديد از حامل‌هاي آدنوويروسي ايجاد شده‌اند. اولي که قبلا هم در مورد آن توضيح داده شده(ترکيبات آدنوويروس_ پلي‌ليزين_ DNA) فقط پروتئين‌هاي پوششي آدنوويروسي را به کار مي‌گيرد که از طريق آنتي‌بادي‌ها و پلي‌ليزين‌ها با DNA جفت مي‌شوند. اين شکل جديد حامل آدنوويروس ممکن است به غلبه بر مشکل التهاب غير مشخص و ايمني سلولي مرتبط با حامل‌هاي آدنوويروسي کمک نمايد. در عين حال هنوز ويژگي‌هاي مهم اندوسيتوز با واسطه گيرنده و تسهيل کردن رها‌سازي ژن‌هاي انتقال‌يافته از اندوزوم‌ها را حفظ مي‌نمايد.نوع دوم حامل آدنوويروسي ايجاد شده، همان است که در آن تمامي ژن‌هاي ويروسي رمزگذار پروتئیني حذف شده‌اند، اين به حامل اجازه مي‌دهد که براي ورود DNAهاي بزرگتري جا داشته باشد(تا ۲۸کیلوباز) و از توليد هر گونه پروتئين ويروسي که ممکن است منجر به واکنش ايمني شود، خود داري کند. حامل آدنوويروسي جديد فقط توالي‌هاي LTR و توالي‌هاي بسته‌بندي ويروس را حفظ کرده و به يک ويروس کمکي براي آماده شدن نياز دارد. در حال حاضر بر روي اين حامل براي استفاده در ژن درماني DMD کار مي‌شود.
استفاده از ويروس مرتبط با آدنو به عنوان حامل‌های ژن درمانی
ويروس‌هاي مرتبط با آدنو، ويروس‌هاي داراي DNA تک‌رشته‌اي هستند که به کمک ويروس ديگري مانند آدنو ويروس براي انجام‌يک عفونت موفقيت آميز نياز دارند. وقتي ويروس کمکي در دسترس نباشد، DNA ويروس مرتبط با آدنو وارد کروموزوم مي‌شود. اين فرايند ادغام بسيار ويژه است و در بازوي بلند q کروموزوم ۱۹ در محل ۱۹q13 رخ مي‌دهد و منجر به ماندگاري پايدار و طولاني‌مدت ژنوم ويروسي مي‌شود که هيچ صدمه مشهودي به سلول‌هاي ميزبان وارد نمي‌آورد. ويروس کوچک است و تنها مي‌تواند ۵/۴ kb از DNA را جا بدهد که اين مساله قابل استفاده بودن ويروس را در انتقال ژن‌هاي بزرگتر محدود مي‌سازد. در مورد ژن‌هاي کوچکتر ويروس مرتبط با آدنو همچنان گزينه ايده‌آلي براي ژن‌درمانی به حساب مي‌آيد و حداقل در محيط کشت مي‌تواند ژن‌ها را به محدوده وسيعي از انواع سلول هدايت کند. امروزه توليد ويروس به تعداد زياد، دشوار است و به عنوان حامل ويروسي ژن درماني هنوز در مراحل تکامل به سر مي‌برد.
