جداسازی موتان‌های اگزوتروف

از این قسمت به بعد به طرف کلونینگ حرکت می‌کنیم. غرض از مطرح کردن این مبحث این است که اگر بخواهیم در آزمایشگاه روی مخمر کار کنیم به طوری که هدفمان بیان ژن خاصی باشد باید از selection markerها استفاده کنیم. اگر سویه کامرشیال دردسترس باشد که می‌توانیم آن را بخریم مثلا فرض کنید ممکن است یک سویه ura auxotroph مورد نیاز داشته باشیم که کامرشیال در دسترس است. اما لازم است بدانیم که می‌توانیم همانطور که شک‌من توانست موتان‌های مورد نظر خود را درآزمایشگاه به دست بیاورد ما هم می‌توانیم این کار را بکنیم.

برای این کار باید مخمر یا قارچ‌رشته‌ای را تحت تأثیر موتاژن قرار دهید و به طوری که باعث random mutation شود.(تارگت موتاسیون هم می‌توانید انجام دهید. سپس موردی را که دنبال آن هستید؛ بجویید و جدا کنید.فرض کنید که در آزمایشگاه به ura auxotroph نیاز داریم، ابتدا مخمر را تحت‌تأثیر UV قرار می‌دهیم. سپس در زمان‌های مختلف، نمونه‌برداری می‌کنیم.

برای این که میزان تابش اشعه را تعیین کنیم باید بررسی کنیم که در عرض چند ثانیه باعث از بین رفتن مخمر می‌شود. معمول این است که آنقدر از UV استفاده کنیم که ۵۰ درصد از مخمرها کشته شوند. اما ما به دنبال این هستیم که ۹۵درصد از سلول‌ها بمیرند. چرا؟ علت این است که وقتی فقط ۵ درصد از سلول‌ها زنده می‌مانند شانس وجود موتاسیون بالاتر است در حالی‌که در باقی‌مانده‌ی سلولی ۵۰ درصدی نیاز به اسکرین و غربال بیشتری وجود دارد.

سلول‌های زنده‌ی باقی‌مانده را روی محیط خیلی غنی رشد می‌دهیم تا بتوانیم تمام موتانت‌ها را به دست بیاوریم. سپس آن‌ها را روی یک محیط خیلی فقیر (محیط حداقل) کشت می‌دهیم. هر موتانتی برای رشد بر روی چنین محیطی نیاز به یک یا چند ماده‌ی دیگر دارد. بنابراین با ساخت محیط‌های کشت متنوعی که از محیط حداقل به علاوه یک یا چند ماده‌ی دیگر (اسیدآمینه؛ نوکلئوتید، ویتامین…) ساخته‌ شده‌اند می‌توانیم پی ببریم که هر کدام از موتانت‌ها نقص در ساخت چه ماده‌ای دارند و ژن موتانت شده را پیدا کنیم. کار چندان سختی نیست وکاملاً عملی است.

نتیجه

• تمام ژن‌های مخمر شناسایی شده‌اند. (از سال ۱۹۹۶ تا کنون)
• در انجام کلونینگ دسترسی به selection markerهای مناسب ضروری است و این به وسیله‌ی موتانت‌ها تأمین می‌شود.
• موتانت مورد نظر ممکن است کامرشیال خریداری شود یا این که در آزمایشگاه ساخته شود.
• برای به دست آوردن موتانت مورد نظر از Random mutagenesis استفاده می‌شود.

ساخت موتانت در آزمایشگاه به وسبله‌ی Random mutagenesis

1. mutagen treatment (بقا باید بین ۵ الی ۵۰ درصد باشد)
2. Grow on Complete mediumرشد روی محیط کاملا غنی
3. تست روی محیط حداقل یا MM[1] (در این حالت نباید هیچ سلولی رشد کند)
4. Broadcategorization: در این مرحله مشخص می‌شود که موتان به دست‌ آمده چه نقص عمده‌ای دارد. نقص در ساخت اسید ‌آمینه، نقص در ساخت اسید‌نوکلئوتید و یا نقص در ساخت ویتامین. برای این کار به محیط‌های کشت حداقل مواد زیر اضافه می‌شود

• یک دسته با کازیین هیدرولیزات غنی می‌شوند: کازیین هیدرولیزات می‌تواند تمام اسید‌آمینه‌های لازم را در اختیار موتانت قرار دهد بنابراین اگر مخمر موتانت در این محیط رشد کرد یعنی نقص در تولید اسید‌آمینه دارد.
• یک دسته با Yeast nucleotide hydrolysate غنی می‌شوند: در این دسته موتانت‌هایی قادر به رشد خواهند بود که نقص در تأمین اسیدنوکلئویک دارند.
• یک دسته با عناصر محلول در آب غنی می‌شوند: در این دسته موتانت‌هایی که نقص در ساخت ویتامین‌ها دارند رشد خواهند کرد.

5. Determining specific requirement: در این مرحله کلونی‌ها را در محیط‌های کشت افتراقی رشد می‌دهیم تا دقیقا مشخص شود که موتانت مورد نظر نقص در ساخت کدام ماده را به طور specific دارد. در واقع در این قسمت دقیقا مشخص می‌شود کدام اسید‌آمینه یا کدام ویتامین مورد نیاز است. (در این حالت در هر محیط کشت از یک individual compound استفاده می‌شود).

[۱] minimal meduim