کلونینگ و بیان در قارچ‌ها

به هر حال بعد از اینن که ترانسفورم انجام شد بایستی با سلام و صلوات ان را پروتوپلاست قارچ را در محیط کشت کامل بگذاریم تا بتواند recover بشود. قارچ در این مرحله بسیار بسیار حساس است. با این امید که ژن داخل شده و بیان هم خواهد شد منتظر رشد قارچ باقی می‌مانیم.

نیازهای اساسی برای ترانسفورماسیون:

• سازه‌‌های وکتوری که دارای پروموتر و ترمیناتور و selection markerهای مناسب باشند.
• سلول قارچی باید برای دریافت DNA، یک سلول شایسته (competent) باشد؛ یعنی باید برای قابل نفوذ بشود به طوری که DNA بتواند وارد شود. شایسته‌ترین فرم برای دریافت DNA شکل پروتوپلاست است.
• به یک سیستم انتخاب نیاز است: به راهی نیاز است که به سرعت بتوان سلول‌های ترانسفورم‌شده را جدا کرد. که به طور معمول از مقاومت‌های دارویی استفاده می‌شود.
• بایستی امکان ایجاد دوباره‌ی فرم مسلیوم به پروتوپلاست برگردد.

روش‌‌شناسی در انتقال DNA

• روش‌های کلاسیک شامل مواردی مثل تیمار پروتوپلاست با یون کلسیم و لیتیم است.
• الکتروپوریشن
• بمباران ذره‌ای یا همان gene gun
• آگروباکتریوم به عنوان یک واسطه‌‌ی ترانسفورماسیون: آگروباکتریوم تومی‌فاسینس[۱] دارای یک پلاسمید بزرگ است که به آن پلاسمید Ti گفته می‌شود. قسمتی از این پلاسمید که DNA ترانسفورم شده داخل آن قرار می‌گیرد را T-DNA می‌نامند که می‌تواند می‌تواند به وسیله‌ کانژوگاسیون به پروتوپلاست سکارومیسس و تعدادی از قارچ‌های رشته‌ای انتقال پیدا کند. T-DNA می‌تواند به هیف[۲] و کونیدیا[۳] هم منتقل شود.

روش‌‌شناسی در انتقال DNA

• روش‌های کلاسیک شامل مواردی مثل تیمار پروتوپلاست با یون کلسیم و لیتیم است.
• الکتروپوریشن
• بمباران ذره‌ای یا همان gene gun
• آگروباکتریوم به عنوان یک واسطه‌‌ی ترانسفورماسیون: آگروباکتریوم تومی‌فاسینس[۱] دارای یک پلاسمید بزرگ است که به آن پلاسمید Ti گفته می‌شود. قسمتی از این پلاسمید که DNA ترانسفورم شده داخل آن قرار می‌گیرد را T-DNA می‌نامند که می‌تواند می‌تواند به وسیله‌ کانژوگاسیون به پروتوپلاست سکارومیسس و تعدادی از قارچ‌های رشته‌ای انتقال پیدا کند. T-DNA می‌تواند به هیف[۲] و کونیدیا[۳] هم منتقل شود.

روش‌های کلاسیک تولید پروتوپلاست و اسفروبلاست:

• برای حذف دیواره‌ی سلولی از آنزیم ها استفاده می‌کنند: این آنزیم‌ها را شرکت بیوتکنولوژی Novozim تولید می‌کند که شامل کیتیناز[۴]، بتاگلوکاناز[۵] هستند که از تریکودرما هارزیانوم[۶] گرفته می‌شود.
• برای پایدار نگهداشتن غشاء پروتوپلاست در غیاب دیواره‌ی سلولی از اسموتیک استابیلایزر استفاده می‌شود که شامل استفاده از سوربیتول، ساکروز، مانیتول، کلسیم، پروتوپلاست، DNA، و PEGچهل درصد است. اسموتیک استابیلایزر به خوبی با آگار پوشانده می‌شود یا به دقت پخش می‌شود.
• استفاده از یون‌های که باعث نفوذ‌پذیری غشاء می‌شوند و غشاء را شایسته (competent) یا قابل نشت می‌کنند. مثل یون‌های لیتیم و کلسیم

[۱] Agrobacterium tumefaciens

[2] hyphae: رشته‌هایی که از مسیلیوم قارچ‌ خارج می‌شوند هیف نامیده می‌شود.

[۳] conidia: قسمت انتهایی هر هیف که برای تولید اسپور تخصص می‌یابد کونیدیا نامیده می‌شود.

[۴] Chitinase: آنزیم هیدرولایتیکی که باعث شکسته شدن پیوندهای گلیکوزیدی در کیتین از اجزای دیواره‌ سلولی قارچ‌ها می‌شود.

[۵] β-glucanase enzyme: آنزیم هیدرولایتیکی که باندهای گلیکوزیدی را در گلیکانها که از زیرواحدهای متنوعی از گلوکز تشکیل شده‌اند؛ می‌شکند.

[۶] Trichoderma harzianum