مخمری به نام سکارومیسس سرویزیه
کمی بیشتر روی ساکارومیسس توقف میکنیم. این قارچ، ارگانیسم مدل بسیار خوبی است. اولا ژنومش کامپکت است؛ ۱۶ تا کروموزوم دارد و سایز ژنوم آن ۱۲ مگاباز است و به خاطر کامپکت بودن در هر هزار الی ۲ هزار جفت باز، یک ژن دارد. بنابراین مقدار Junk DNA در آن خیلی زیاد نیست و این برای ما که میخواهیم روی آن تحقیقات کنیم بسیار خوب
- ساکارومیسس مدل ایدهآلی است برای تجزیه و تحیلی عملکردی large scale
ویژگیهای ژنتیکی ساکارومیسس سرویزیه که آن را به یک مدل خوب برای کار آزمایشگاهی تبدیل میکند عبارتند از:
- ژنوم کامپکت دارد یعنی ۷۰ درصد آن کد کننده است و DNAی ریبوزومی نیست.
- ۱۶ کروموزوم دارد.
- ژنوم آن ۱۲ مگاباز است و ۶۲۰۰ ژندارد
به طور میانگین در هر دو کیلوباز یک ژن قرار گرفتفه است.است.
چرخه سلولی مخمر ساکارومیسس سرویزیه
در این بخش نمیخواهیم خیلی روی فیزیولوژی این قارچ بحث کنیم اما در این قسمت لازم است بدانیم که این قارچ دو فرم هاپلویید و دیپلویید (به بخش پاورقی سه مراجعه کنید) دارد. و همینطور دو نوع mating type که مربوط به فنوتیپهای جنسی در مخمر است. که به نامهای «α» و «a» خوانده میشوند و آنها را به شکل MATα و MATa نمایش میدهند. هر کدام از این سلولها فاکتوری به همین نام دارم یعنی -Factorα و a-Factor که هر کدام از سلول مخصوص به خود ترشح میشوند. زمانی که سلولها در مجاورت هم قرار میگیرند و تحت تأثیر این فاکتورها قرار میگیرند تغییراتی پیدا میکنند که باعث میشود آماده جفتگیری شوند.
در واقع یک برجستگی به نام «shemoo» ایجاد میکند که باعث میشود دو سلول به وسیلهی آن برجستگی به هم برسند و
لقاح انجام شود. بعد از لقاح یک سلول دیپلویید داریم که ممکن است مدتها همینطور بماند ولی در شرایط مناسب دوباره به شکل هاپلویید برمیگردد که این کار به وسیلهی میوز انجام میشود. محققانی که مایلند بر روی میوز کار کنند میتوانند از این phase استفاده کنند.
سؤال دانشجو: تاکید بر این که a و α چه چیزهایی هستند؟
در واقع هم سلول a و سلول α داریم. هم فرمون a و فرمون α داریم. و هم رسپتور a و رسپتور آلفا داریم. هر سلولی فرمون همنام خودش و رسپتور هم نام فرمون مقابل خودش دارد. یعنی رسپتور a روی سلول a است که فرمون α ترشح میکند.
این که قارچ چه هویتی دارد مربوط به لوکوسهایش است. البته گاهی ممکن است به علت نوترکیبیphenotype switching در قارچ اتفاق بیفتد و mating type آن تغییر کنید و از آلفا به a و یا برعکس تبدیل شود. البته بنا نیست خیلی وارد جزیات قارچشناسی این پدیده بشویم زیرا بحث مولکولی آن خیلی طولانی است. با این حال ساختار شیمیایی این دو نوع فرمون در شکل ۳ نمایش داده شده است.
نمایش داده شده است. فرمون آلفا سادهتر
است. در حالی که فرمون a
یک زنجیر جانبی دارد که به کمک یک گوگرد به سیستین در رشتهی پلیپپتیدی متصل شده
است.
چرا باید به عنوان یک بیوتکنولوژیست در مورد این فاکتورها و mating typeها بدانیم؟
علت این است که فاکتور آلفا که در واقع یک فرمون جنسی است درزمان لقاح بسیار زیاد ترشح میشود و کارش سیگنالینگ است. مامیتوانیم از خواص سیگنالینگ ترشحی mating type آلفا در آزمایشگاه کمک بگیریم. بدون این که بحث لقاح مطرح باشد. که در قسمتهای بعدی بیشتر شرح داده خواهد شد.
· در ساکارومیسس سرویزیه برای لقاح دو نوع سلول (mating type) وجود دارد.
· هر سلول فرمونی به همان نام ترشح میکند.
· هر سلولی یک رسپتور برای سلول مقابل خود دارد.
· هر فرمون بعد از اتصال به رسپتورش بر روی سلول مقابل باعث ایجاد یک برجستگی یا شمو میشود.
· بعد از لقاح یک سلول دیپلویید ایجاد میشود که با میوز مجددا سلولهای هاپلویید میسازد از این مرحله برای مطالعهی میوز دریوکاریوتها استفاده میشود.
· هویت و فنوتیپ هر قارچ به لوکوسهایش بستگی دارد.
· اهمیت فاکتور آلفا برای کاربردی است که در آزمایشگاه برای ایجاد سیگنالینگ دارد.
· فرمون آلفا از فرمون a سادهتر است.
اهمیت موتان بودن یا وحشیبودن در قارچها چیست
تیپ وحشی و جهش یافته یا موتان در قارچها
دو اصطلاح مهم که باید به خوبی با آن آشنا باشید و کاربرد آنها را در مبحث کار با قارچ بدانید عبارتند از
- wild type: نوع وحشی قارچ که از طبیعت جدا میشود و همهی اختصاصات طبیعی قارچ را دارد این تیپ از قارچ میتواند روی محیط حداقل رشد کند و نیاز به مادهی خاصی ندارد.
- mutant type معمولاً به وسیلهی یک موتاسیون حاصل میشوند. موتانتهایی که اگزوتروف Auxotroph هستند کاربرد زیادی در آزمایشگاه دارند. یک قارچ اگزوتروف قارچی است که در تولید یک مادهی خاص نسبت به نوع وحشی نقص دارد بنابراین برای رشدش به یک مادهی خاصی نیازدارد. مثلاً وقتی میگوییم یک قارچ نسبت به اوراسیل، اگزوتروف (uracil auxotroph) است یعنی باید به محیط حداقل اوراسیل اضافه کنیم چرا که نقص در ژنی که سازندهی اوراسیل است اتفاق افتاده است و این حالت موتانت قادر به ساختن اوراسیل نیست.
Conditionl Lethal
conditional lethal این موتانتها فنوتیپی دارند که فقط در شرایط خاصی بیان میشود. برای مثال وقتی قارچ در شرایط عادی و permissive (قابل قبول و مجاز) قرار دارد؛ هیچ اختلالی در سلول دیده نمیشود و سلول سالم است ولی وقتی شرایط غیرعادی و غیرمجاز میشود سلول اثر موتاسیون خود را نشان میدهد. برای مثال اگر سلول موتان حساس به گرما (temperature sensitive) باشد، تغییر دما از دمای مجاز باعث میشود سلول بمیرد. مثلا تغییر از دمای ۲۵ درجهی سانتیگراد به ۳۷ درجه سانتیگراد میتواند اثر موتاسیون را مشخص کند و سلول موتان در این شرایط ساختارش را از دست بدهد و عملکرد پروتئینهایش از بین برود. سلولهای حساس به گرما در آزمایشگاه برای کار تحقیقی کاربرد زیادی دارند.
جدا کردن سلولهای حساس به دما temperature sensitive راهی برای مطالعهی ژنها
درشکل ۱ تصویر دانشمندی به نام دکتر راندی شکمن (Randy Schekman) را میبینید که در سال ۲۰۱۳ نوبل قیزیولوژی و پزشکی را از آن خود کرد. در واقع او با جداسازی سویههای حساس به دما توانست بر روی وقایع مولکولی ترشح پروتئین به خارج از سلولها مطالعه کند. قبل از کشفیات ایشان اطلاعی از وقایع مولکولی پروتئین به خارج از سلول وجود نداشت و فقط میدانستیم که پروتئنی وقتی ساخته میشود به شبکه اندوپلاسمی (ER) رفته و بعد از آن به گلژی انتقال پیدا میکند و سپس در داخل وزیکولهایی به بیرون از سلول میرود.
کاری که ایشان انجام داد این بود که طی ۲۰ سال مطالعه با همان روشهای موتاژنس معمولی موتانهایی را پدید آورد (روشهای موتاژنزیس معمولی که هم ممکن است از UV و هم از موادشیمیایی استفاده شود؛ مثل قرار دادن مخمر در مقابل UV یا نیتروز) از آنجایی که بسیار علاقمند بودند به ترشح پروتئین؛ مسیر ترشحی پروتئین را بررسی کردند. برای این کار ابتدا به دنبال موتانتهایی گشت که حساس به دما یا temperature sensitive بودند؛ به،طوری که هر کدام از آنها قادر نبودند یک نوع از پروتئینها را ترشح کنند. بنابراین یک پروتئین مثل انورتاز (invertase) را هدف قرار داد. موتاسیون را انجام داد و بعد انتخاب کرد.
او سلولهایی را انتخاب کرد که در دمای ۲۵ درجه سانتیگراد میتوانستند انورتاز را ترشح کنند اما در دمای ۳۷ درجه این توانایی را از دست میدادند. بعد از جداسازی این سلولها آنها را دسته بندی کرد. همانطور که در اسلاید ۱۷ میبینید او ۵ گروه موتانت به دست آورد که همهی آنها قادر به ترشح انورتاز در ۳۷ درجه نبودند. اما نقص ترشح پروتئین در هر کدام از این دستهها به یک قسمتی از مسیر ترشح پروتئین برمیگشت و مثل هم نبود.
اگر به شکل دقت کنید میبینید که گروه اول یا گروه A قادر به این نیستند که پروتئین را وارد شبکهی اندوپلاسمی کنند و در نتیجه پروتئین در سلول تجمع مییابد؛ گروه دوم (B) نمیتوانند پروتئین را شبکه اندوپلاسمی خارج کنند. در گروه سوم (C) تجمع در وزیکولهایی اتفاق میافتاد که از شبکهی اندوپلاسمی راهی شبکه گلژی بودند و در نتیجه این وزیکولها تجمع پیدا میکردند؛ گروه چهارم (D) در گلژی تجمع مییافتند و قادر به ساخت وزیکول ترشحی به خارج از سلول
نبودند. در گروه پنجم (E) وزیکولهای ترشحی گلژی به غشا متصل نمیشدند و این وزیکولها داخل سیتوپلاسم تجمع پیدا میکرد. به این ترتیب ۵ دسته سلول موتان به دست آمد که همگی نمیتوانستند پروتئین را ترشح کنند. با لقاح دادن این گروهها و بررسی نسلهای بعدی او توانست تمام تقدم و تأخرهای مربوط به بیان ژنهایی که در این مسیر دخالت داشتند، پیدا کند. او حدود ۶۲ الی ۶۳ ژن را به عنوان ژنهای دخیل در مسیر ترشح پروتئین شناسایی کرد.
نکات خلاصه
- به کمک کار بر روی سویههای حساس به دما میتوان تحقیقات مهم ژنتیک مولکولی را به انجام رساند.
- راندی شک من که برنده نوبل ۲۰۱۳ شد وقایع مولکولی ترشح پروتئین به خارج از سلول یوکاریوتی را با مطالعه بر روی سویههای حساس به دما معرفی کرد.
- دکتر شکمن، ۵ موتانت حساس به دما را جدا کرد که هر کدام از آنها در قسمتی از روند ترشح پروتئین که از قبل شناخته شده بود؛ نقص داشتند.
- دکتر شکمن با لقاح این موتانتها و بررسی زادهها توانست حوادث مولکولی ترشح پروتنین به خارج از سلول را شرح دهد.
- ۶۲ الی ۶۳ ژن در مسیر ترشحی پروتئین به خارج از سلول یوکاریوتی دخیل هستند.
تاریخچهی کار بر روی مخمر بخش کوتاهی است که دربارهی مطالعه بر مخمرها صحبت می کند و علاوه بر این روشهای جداسازی موتانهای اگزوتروف را نیز میتوانید در این قسمت بخوانید.
برای تغییر این متن بر روی دکمه ویرایش کلیک کنید. لورم ایپسوم متن ساختگی با تولید سادگی نامفهوم از صنعت چاپ و با استفاده از طراحان گرافیک است.