روش تعویض محیط کشت سلول های چسبنده

• برای کشت سلول رعایت شرایط استریل بسیار ضروری است.
• معمولا از هودکلاس II برای کار کشت سلول استفاده می شود.
• برای شروع کار باید از ابتدا FBS، محیط کشت و تمام مواد یخچالی و فریزری مورد نیاز را در بن ماری به دمای ۳۷ درجه برسانیم.
• برای کشت رده های متفاوت سلول از محیط کشت های متناسب ان سلول استفاده می شود. مثلا برای سلول های HEK293T  از DMEM با گلوکز بالا استفاده می کنیم.
• سلول های که در کشت سلولی استفاده می شوند در سه دسته ی کلی قرار می گیرند: سلول های چسبنده یا Adhesive که به کف فلاسک می چسبند. سلول های نیمه چسبنده یا Semi Adhesive و سلول های آزاد که به کف فلاسک متصل نمی شوند.

برای تعویض محیط کشت سلول های چسبنده به کف فلاسک به راحتی می توان  محیط قبلی را با کمک پیپت  دور ریخت و به آن محیط جدید اضافه کرد.

درون هر محیط کشت باید آنتی بیوتیک های ضد باکتریال و ضد قارچی اضافه شود. مهمترین آنتی بیوتیک های باکتریایی پنی سیلین و استرپتومایسین است که تحت عنوان پنسترپ در آزمایشگاه کشت استفاده می شود. آمفوتریپسین B نیز علیه قارچ ها استفاده می گردد. در شرایطی که قصد داشته باشیم تا رده ی سلولی پایا بسازیم باید از یک آنتی بیوتیک انتخابی برای دا کردن سلول های مورد نظر استفاده کنیم. از جمله آنتی بیوتیک های انتخابی برای سلول های پستانداران، هیگرومایسین و نئومایسین می باشد.

غلظت آنتی بیوتیک ها در محیط کشت

اینکه چه میزانی از غلظت این انتی بیوتیک ها نیاز است تا سلول ها بتوانند رشد کنند با توه به غلظت آنتی بیوتیک موجود و حداقل غلظت لازم برای مرگ باکتری یا قارچ که به حیات سلول پستاندار مورد نظر آسیب نزند نیاز داریم.

• ماندگاری آنتی بیوتیک های باکتریال مانند پنسترپ بالاست بنابراین می توان در روز اول به کل محیتویات محیط کشت نیم لیتری که خریداری کرده ایم به نسبت ۲ درصد آنتی بیوتیک اضافه کنیم یعنی به ۵۰۰ میلی لیتر ۱۰میلی لیتر پنسترپ می زنیم.
• آمفوتریپسین B ماندگاری بالایی ندارد. هر روز در زمان تعویض محیط باید این آنتی بیوتیک هم اضافه شود.
• هیگرومایسین با غلظت ۱gr/20ml خریداری می شود. در حالی که در محیط کشت سلولی به غلظت ۱۵۰ میکروگرم در یک میلی لیتر نیاز است. بنابراین به هر ۱ میلی لیتر از محیط کشت ۳ میکرولیتر از این انتی بیوتیک اضافه می کنیم
• کلیه ی مراحل افزودن آنتی بیوتیک ها به محیط کشت سلول باید زیر هود کلاس II انجام گیرد.
• آنتی بیوتیک ها را بهتر است دور از نور نگهداری کنیم و فقط برای زمان استفاده از یخچال خارج کنیم.
• اگر رده ی سلولی که با آن کار میکنیم از نوع سلول های چسبنده به ته فلاسک باشند، برای پاساژ دادن و ایجاد فلاسک سلولی جدید از تریپسین استفاده میکنیم.
• بهتر است همیشه تریپسین را الیکوت کرده و در فالکون های ۱۵ ml در فریزر نگهداری کنیم.
• حداکثر یک روز قبل از کار می توان یک فالکون تریپسین را از فریزر به یخچال منتقل کرد.

FBS به چسبندگی سلول ها به کف فلاسک کمک میکند و تریپسین های باقی مانده در محیط را خنثی میکند

هفت گام برای تعویض محیط کشت

گام اول: محیط کشت را به اندازه ی تمام فلاسک هایی که قرار است تعویض شوند جدا کنیم. مثلا برای دو فلاسک ۲۵T به اندازه ی ۲*۳=۶ میلی لیتر محیط آماده کنیم.

گام دوم: محیط داخل هر فلاسک را خارج کرده و (اختیاری) سلول ها را یکبار با PBS شستشو دهیم.

گام سوم: برای دا شدن سلول های چسبیده به ته فلاسک از تریپسین ۲ درصد استفاده میکنیم. این محلول را در هر فلاسک به اندازه ای میریزیم که مطمئن شویم تمام سطح سلول ها را در بر گرفتهاست. مثلا در یک فلاسک ۲۵T به اندازه ی ۱ml میریزیم. و به مدت یک تا دو دقیقه در انکوباتور شیکر دار می گذاریم تا آنزیم تریپسین عمل کند.(برای عملکرد بهتر می توان قبل از گذاشتن فلاسک در انکوباتور ظرف را با دست به آرامی تکان دهیم تا محلول حاوی تریپسین به تمام سلول ها برسد.)

گام چهارم: بعد از گذشت مدت زمان فوق، به همان حجمی که از تریپسین روی سلول ها ریختیم از FBS روی آن ها میریزیم تا تریپسین را خنثی کند. مدت زمان اثر تریپسین باید در هر آزمایشگاه و با توه به هر نوع سلول تنظیم و ست گردد. این مدت زمان بستگی به میزان چسبندگی و اتصال سلول ها به هم و به کف فلاسک دارد و غالبا اگر زیاد باشد موجب می شود آنزیم تریپسین غشای سلول ها را تخریب کند و آن ها را از بین ببرد.

گام پنجم: با پیپت یا پیپتور به مدت ۵ الی ۱۰ دقیقه مایع داخل فلاسک را پیپت میکنیم تا جایی که تمامی سلول ها کنده شده و به طور کامل از هم جدا شوند.

گام ششم: محتویات داخل فلاسک را درون یک فالکن ۵۰ میریزیم و بعد سانتریفوژ می کنیم. معمولا ۱۰ دقیقه در دور ۱۷۰۰ تا ۱۸۰۰ دور rpm برای این سانتریفوژ کافی است.

گام هفتم: بعد از اینکه این سلول ها رسوب کردند محلول رویی را کاملا خار میکنیم و پلت سلولی را با محیط کشتی کهاز قبل تهیه کردیم رقیق می کنیم. اگر محتویات سلولی را به دو فلاسک می خواهیم اضافه کنیم بنابر این با حجم محیط کشت مورد نیاز برای دو فلاسک این کار را انجام میدهیم و بعد به هر فلاسک نصف این محیط را اضافه میکنیم.

هر فلاسک ۲۵T بعد از رسیدن به تراکم ۹۰ درصد از سلول ، در حدود ۳و نیم میلیون سلول خواهد داشت.